肌球蛋白重链7基因来源的miR-208b-3p促进心肌成纤维细胞中纤维化相关基因表达
Myosin Heavy Chain 7 Gene-derived miRNA-208b-3p Enhances the Fibrosis-related Gene Expression in Cardiac Fibroblasts
- 中山大学学报（医学科学版） 2023年44卷第4期 页码：642-650
- 作者机构：
1.南方医科大学附属广东省人民医院//广东省医学科学院医学研究部， 广东 广州 510080
2.南方医科大学附属广东省人民医院//广东省医学科学院检验科，广东 广州 510080
3.南方医科大学附属广东省人民医院//广东省医学科学院麻醉科，广东 广州 510080
- 作者简介：
张梦珍，研究方向：心肌纤维化的分子机制，E-mail：ciwei226@126.com
- 基金信息：国家自然科学基金(82070254;82200325);广州市科技计划项目(202201011627);广东省自然科学基金(2022A1515012522;2022A1515012175;2021A1515220122;2021A1515111173);广东省卫健委课题(A2021002;A2022334);广东省人民医院心血管专项(2020XXG003)
DOI：10.13471/j.cnki.j.sun.yat-sen.univ(med.sci).20230421.002
中图分类号： R363.2纸质出版日期：2023-07-20，
收稿日期：2022-12-04，
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张梦珍,翟琳,郭林林等.肌球蛋白重链7基因来源的miR-208b-3p促进心肌成纤维细胞中纤维化相关基因表达[J].中山大学学报（医学科学版）,2023,44(04):642-650.
ZHANG Meng-zhen,ZHAI Lin,GOU Lin-lin,et al.Myosin Heavy Chain 7 Gene-derived miRNA-208b-3p Enhances the Fibrosis-related Gene Expression in Cardiac Fibroblasts[J].Journal of Sun Yat-sen University(Medical Sciences),2023,44(04):642-650.
张梦珍,翟琳,郭林林等.肌球蛋白重链7基因来源的miR-208b-3p促进心肌成纤维细胞中纤维化相关基因表达[J].中山大学学报（医学科学版）,2023,44(04):642-650. DOI： 10.13471/j.cnki.j.sun.yat-sen.univ(med.sci).20230421.002.
ZHANG Meng-zhen,ZHAI Lin,GOU Lin-lin,et al.Myosin Heavy Chain 7 Gene-derived miRNA-208b-3p Enhances the Fibrosis-related Gene Expression in Cardiac Fibroblasts[J].Journal of Sun Yat-sen University(Medical Sciences),2023,44(04):642-650. DOI： 10.13471/j.cnki.j.sun.yat-sen.univ(med.sci).20230421.002.
摘要
目的
2
探究肌球蛋白重链7基因来源的微小RNA-208b-3p（miR-208b-3p）对心肌成纤维细胞纤维化表型的调控作用。
方法
2
通过miRNA 表达谱芯片分析18周龄的糖尿病db/db小鼠和db/m对照小鼠心肌中差异的miRNAs。通过实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测miR-208b-3p 在血管紧张素Ⅱ（Ang Ⅱ）和高糖/葡萄糖氧化酶（G/Go）处理的C57BL/6乳小鼠心肌细胞（NMVCs）和心肌成纤维细胞（mCFs）中的表达；利用CCK8细胞增殖实验、流式细胞术和纤维化相关蛋白（包括COL1A1、COL3A1和α-SMA）表达检测来了解miR-208b-3p对mCFs纤维化表型的影响；双萤光素酶报告基因实验检测miR-208b-3p与潜在靶基因Mtf2和Pgrmc1 3'端非翻译区（3'-UTR）的结合作用；利用RT-qPCR和Western blot 法分别检测miR-208b-3p转染的 mCFs中Mtf2 和Pgrmc1 表达；通过小干扰RNA（siRNA）抑制Mtf2和Pgrmc1表达，并检测对mCFs中纤维化相关蛋白表达的作用。
结果
2
miRNA 表达谱和RT-qPCR结果证实miR-208b-3p在糖尿病db/db小鼠心肌中表达显著升高。miR-208b-3p前体与宿主基因Myh7在db/db小鼠心肌中表达显著升高，miR-208b-3p与Myh7 mRNA在乳小鼠来源的mCFs和NMVCs中均有表达，但在NMVCs中水平更高。miR-208b-3p在Ang Ⅱ和G/Go处理后的mCFs和NMVCs中表达均明显升高。miR-208b-3p可显著增加mCFs中纤维化相关蛋白COL1A1、COL3A1和α-SMA表达，但不影响mCFs的增殖能力和细胞周期分布特征。双萤光素酶报告基因实验显示miR-208b-3p与Mtf2和Pgrmc1 3'-UTR有结合作用。miR-208b-3p可在转录后水平抑制mCFs中Mtf2和Pgrmc1表达。miR-208b-3p、Mtf2 siRNA和Pgrmc1 siRNA均能一致性地促进mCFs中纤维化相关蛋白表达。
结论
2
miR-208b-3p通过靶向Mtf2和Pgrmc1基因发挥促进mCFs中纤维化相关基因表达的作用。
Abstract
Objective
2
To investigate the effect of myosin heavy chain 7 gene-derived miRNA-208b-3p on the fibrotic phenotype of cardiac fibroblasts.
Methods
2
miRNA chip array was performed to detect the dysregulated miRNAs in the myocardium of diabetic db/db mice and db/m control mice. Neonatal mouse ventricular cardiomyocytes （NMVCs） and cardiac fibroblasts （CFs） were isolated from C57BL/6 mice and cultured. Real-time quantitative PCR （RT-qPCR） was conducted to determine the expression of miR-208b-3p in mouse CFs and NMVCs subjected to angiotensinⅡ（AngⅡ） and high glucose plus glucose oxidase （G/Go） treatment， respectively. Cell counting kit 8（CCk8） assay， flow cytometry and determination of fibrosis-related protein， including COL1A1， COL3A1and α-SMA， were performed in mCFs transfected with miR-208b-3p. Dual luciferase reporter assay was performed to confirm the interaction between miR-208b-3p and the 3'-UTR of metal response element binding transcription factor 2 （Mtf2） and progesterone receptor membrane component 1（Pgrmc1）， respectively. The expressions of Mtf2 and Pgrmc1 at the mRNA and protein levels in mCFs after miR-208b-3p mimic transfection were determined using RT-qPCR and Western blot assay， respectively. The small interfering RNA （siRNA） was used to inhibit Mtf2 and Pgrmc1 expression in mCFs， and the effects of Mtf2 siRNA， Pgrmc1 siRNA and miR-208b-3p on fibrosis-related protein expression in mCFs were investigated.
Results
2
Results of miRNA chip array and RT-qPCR assay showed that miR-208b-3p was up-regulated in the myocardium of the diabetic db/db mice. miR-208b precursor and the host gene of Myh7 were consistently increased in db/db mice. miR-208b-3p and Myh7 mRNA were expressed in mCFs and NMVCs， but the levels of miR-208b-3p and Myh7 mRNA in NMVCs were much higher than those in mCFs. miR-208b-3p was up-regulated in mCFs and NMVCs subjected to Ang Ⅱ and G/Go treatment， respectively. miR-208b-3p could significantly enhance fibrosis-related protein， including COL1A1， COL3A1 and α-SMA， in mCFs， without affecting the proliferation activity and cell cycle distribution of mCFs. Dual luciferase reporter assay revealed the interactions of miR-208b-3p with the 3'-UTR of Mtf2 and Pgrmc1. The results of RT-qPCR and Western blotting confirmed that miR-208b-3p inhibited Mtf2 and Pgrmc1 expression at the post- transcriptional level. Transfection with miR-208b-3p mimic， Mtf2 siRNA and Pgrmc1 siRNA could consistently enhance the fibrosis-related protein expression in the cardiac fibroblasts.
Conclusions
2
miR-208b-3p enhances fibrosis-related gene expression by targeting Mtf2 and Pgrmc1in mCFs.
关键词
心肌纤维化微小RNAmiR-208b-3p心肌成纤维细胞
Keywords
cardiac fibrosismicroRNAmiR-208b-3pcardiac fibroblast
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