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黄芩素对MC3T3-E1体外成骨分化及对口腔常见菌的抑菌作用
基础研究 | 更新时间：2024-07-30
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    • 黄芩素对MC3T3-E1体外成骨分化及对口腔常见菌的抑菌作用

    • Effect of Baicalein on Osteogenic Differentiation of MC3T3-E1 Cells and Its Bacteriostasis against Common Oral Bacteria

    • 王越

      1 ，  

      林芳辰

      1 ，  

      苏琦

      1 ，  

      黄霞

      1 ，  

      周志迎

      2 ，  
    • 中山大学学报（医学科学版）   2024年45卷第4期 页码：602-612

    • DOI：10.13471/j.cnki.j.sun.yat-sen.univ（med.sci）.20240617.009    

      中图分类号： R781.42

    • 纸质出版日期：2024-07-20，

      收稿日期：2024-04-25，

      录用日期：2024-06-13

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  • 王越,林芳辰,苏琦等.黄芩素对MC3T3-E1体外成骨分化及对口腔常见菌的抑菌作用[J].中山大学学报（医学科学版）,2024,45(04):602-612. DOI： 10.13471/j.cnki.j.sun.yat-sen.univ（med.sci）.20240617.009.

    WANG Yue,LIN Fangchen,SU Qi,et al.Effect of Baicalein on Osteogenic Differentiation of MC3T3-E1 Cells and Its Bacteriostasis against Common Oral Bacteria[J].Journal of Sun Yat-sen University(Medical Sciences),2024,45(04):602-612. DOI： 10.13471/j.cnki.j.sun.yat-sen.univ（med.sci）.20240617.009.

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    摘要

    目的

    研究不同浓度黄芩素对MCT3-E1增殖及生物学行为的影响，以及其对口腔常见菌的抑菌作用，并探讨其相关机制。

    译

    方法

    将MC3T3-E1细胞分别培养在0、6、12、18、24 μmol/L的黄芩素浓度下，通过CCK-8实验检测黄芩素处理后MC3T3-E1的增殖活性；对成骨诱导培养后的MC3T3-E1进行ALP活性检测；RT-PCR法检测RunX2、BMP2、Osterix基因的表达差异。K-B纸片法检测黄芩素处理24 h对大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，血链球菌的抑菌效果。

    译

    结果

    黄芩素可在一定程度降低细胞增殖活力，但不影响其继续增殖。18 μmol/L的黄芩素可以提高MC3T3-E1的ALP活性，并有效上调BMP2与Osterix的表达，下调RunX2的表达，能有效抑制金黄色葡萄球菌与血链球菌的增殖（P<0.05）。

    译

    结论

    适宜浓度的黄芩素（18 μmol/L）对MC3T3-E1细胞成骨分化有促进作用，并且可有效抑制口腔常见菌（金黄色葡萄球菌与血链球菌）的增殖。

    译

    Abstract

    Objective

    To investigate the impact of varying concentrations of baicalein on the proliferation and biological responses of MC3T3-E1 cells， as well as the antibacterial efficacy of baicalein against prevalent oral bacteria， and to elucidate the underlying mechanisms.

    译

    Methods

    MC3T3-E1 cells were exposed to different concentrations of baicalein （0， 6， 12， 18， and 24 μmol/L） and cell viability was determined by using the CCK-8 assay. Alkaline phosphatase （ALP） activity of MC3T3-E1 cells following osteogenic induction was assessed. RT-PCR was used to examine the expression of RunX2， BMP2， and Osterix. After 24 hours of treatment， the antibacterial potential of baicalein against Escherichia coli， Staphylococcus Aureus and Streptococcus Sanguis was evaluated by using the K-B paper disk method.

    译

    Results

    Baicalein exhibited a modest reduction in proliferation of MC3T3-E1 cells but without affecting their sustained proliferation. Baicalein at a concentration of 18 μmol/L enhanced ALP activity of MC3T3-E1 cells， upregulated BMP2 and Osterix expression， downregulated RunX2 expression， significantly inhibited the proliferation of Staphylococcus Aureus and Streptococcus Sanguis （P < 0.05）.

    译

    Conclusions

    Baicalein at an optimal concentration （18 μmol/L） demonstrated a promotional effect on the osteogenic differentiation of MC3T3-E1 cells and effectively suppressed the proliferation of common oral bacteria， including Staphylococcus Aureus and Streptococcus Sanguis.

    译

    关键词

    前成骨细胞; 黄芩素; 成骨作用; 抑菌; 分化; 增殖

    译

    Keywords

    preosteoblasts; baicalein; osteogenesis; bacteriostasis; differentiation; proliferation

    译

    口腔常见疾病牙周病、种植体周围炎、微种植体周围炎均是以微生物为始动因子，局部组织发生慢性炎症性反应，牙体支持组织逐渐破坏丧失，牙槽骨逐渐吸收的疾病。对于此类牙周支持组织疾病治疗的长期目标主要是清除口腔内菌斑，保持口腔卫生，同时阻止局部炎症继续发展，阻断骨吸收，尽可能恢复原有的骨量。药物辅助治疗牙周支持组织炎症是常见的辅助治疗手段，近年来多有文献提及以中药治疗此类疾病。黄芩素是从黄芩根部主要提取出的一种天然黄酮类化合物。其性状为黄色的针状结晶，化学名称为 5，6，7-三羟基黄酮，分子量为 270.2，在中药领域已有上千年的历史，已被证实在口腔颌面部肿瘤、黏膜疾病、硬组织疾病、炎症性疾病中均发挥重要作用［

    1-5］。前期有研究表明黄芩素可阻断Toll样受体2（Toll-like receptors 2， TLR2）和Toll样受体4（Toll-like receptors 4， TLR4）及其下游信号髓样分化因子 （myeloid differentiation factor 88， MyD88）、p38丝裂原活化蛋白激酶（p38 mitogen-activated protein kinase，p38 MAPK）、核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）的转导，从而减轻大鼠实验性牙周炎的炎症反应和牙槽骨丧失［6］。0.01 mg / m L黄芩苷可促进人牙周膜细胞（human periodontal ligament cell ， HPLC）增殖，上调骨保护素（osteoprotegerin，OPG）下调核因子受体激活因子-κB配体（receptor activator for nuclear factor-κB ligand，RANKL）的mRNA和蛋白表达，显著降低RANKL/OPG表达比值，增加核心结合因子α1（core binding factor α1，CBF α1）和骨钙素（osteocalcin，OC）的mRNA和蛋白表达［7］。体内体外实验均已证实黄芩素在抑制口腔常见菌、减少炎症环境下的牙槽骨丧失、有效促进各类成骨细胞分化成骨方面的潜力［8-9］。本实验旨在观察黄芩素有效促进成骨分化的最适浓度，并评价该浓度下的抑菌能力，探索出既能高效抗菌又能促进成骨的适宜剂量，为黄芩素在口腔内各种疾病中的应用提供一定理论依据。
    译

    1 材料与方法

    1.1　主要试剂与材料

    小鼠前成骨细胞MC3T3-E1细胞（广州威佳生物科技有限公司，中国）。黄芩素（乐美天医药/德思特生物有限公司，中国）；CCK-8 试剂盒（广州威佳生物科技有限公司，中国）；OPTI-MEM（Invitrogen，美国）；FBS（ExCell Bio，中国）；α-MEM（GIBCO，中国）；胰蛋白酶（ECOTOP，英国）；STAT3 抗体（abcam，中国）；Thapsigargin（MCE，美国）；MK-28（MCE，美国）；DL2000（TaKaRa，日本）；1 kbp DNA Ladder Marker（TaKaRa，日本）；PrimeSTAR HS DNA-Polymerse（TaKaRa，日本）；DNA 凝胶回收试剂盒（DONGSHENG BIOTECH，中国）；SYBR Green PCR Master Mix（TOYOBO，中国）；金黄色葡萄球菌 ATCC6538，（鲁微科技有限公司，中国）；乙型溶血性血链球菌 ATCC21059，（鲁微科技有限公司，中国）；大肠杆菌CMCC（B）44102，（鲁微科技有限公司，中国）；台式离心机（中佳，中国）；PCR 仪（黑马，中国）；倒置光学显微镜（Olympus，日本）；紫外分光光度计 ND-1000（NanoDrop，美国）；DNA 电泳仪（Tanon，中国）；凝胶成像系统（培清科技，中国）；荧光定量 PCR 仪（ABI，美国）。

    译

    1.2　方 法

    1.2.1　MC3T3-E1细胞培养

    将MC3T3-E1细胞培养于DMEM高糖培养基中（含质量分数10%胎牛血清），培养条件为标准条件（体积分数5%CO2、37 ℃、饱和湿度），培养至细胞生长密度达80%时，胰蛋白酶消化并进行传代，取生长状况良好、处于对数生长期细胞进行后续实验。

    译

    1.2.2　黄芩溶液配置与作用浓度筛选

    配置100 mmol/L 的黄芩素母液并使用0.22 μmol/L 无菌过滤器过滤，根据实验所需DMEM高糖培养基调配成所需浓度。CCK-8法对本次实验选取浓度进行预实验，制备含黄芩素 0（空白对照） 、50、 100、150、200 μmol/L 的培养基，培养 0、1、7、14 d后测定OD值，每组浓度重复3次，检测细胞增殖情况。

    译

    1.2.3　实验分组

    根据预实验所得出的半数抑制浓度（IC50）为24 μmol/L 作基础，按 100%、75%、50%、25%的比例作梯度细化为后续实验的药物浓度。实验组更换为浓度分别为 6、12、18、24 μmol/L的黄芩素条件培养基［含质量分数10%FBS，青霉素与链霉素双抗（青霉素：10 000 U/mL，链霉素：10 000 µg/mL）］，CCK-8实验与成骨基因表达实验对照组更换为α-MEM完全培养基［含质量分数10%FBS，青霉素与链霉素双抗（青霉素：10 000 U/mL，链霉素：10 000 µg/mL）］；ALP活性测定实验对照组更换为DMSO完全培养基［含质量分数10%FBS，青霉素与链霉素双抗（青霉素：10 000 U/mL，链霉素：10 000 µg/mL）］。

    译

    1.2.4　CCK-8检测

    MC3T3-E1以5×104个/mL接种于每孔100 μL的96孔板，每组5个复孔，分别培养1、3、7 d时加入CCK-8试剂检测吸光度值，计算各组细胞相对增殖率与细胞毒性评价。相对增殖率=黄芩素组吸光度均值/阴性对照组吸光度均值×100%。细胞毒性评价标准参考文献中以相对增殖率为评价标准，评级为1~2代表药物有较好安全性（表1）。

    译

    表1  细胞毒性分级表
    Table 1  Cytotoxicity grading table
    Cytotoxicity gradeRelative cell proliferation rate/%
    0 ≥100
    1 75～99
    2 50～74
    3 25～49
    4 1～24
    5 0
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    1.2.5　碱性磷酸酶活性检测

    各组细胞分别诱导0、7、14 d后，去除原培养液，PBS冲洗后吸干，每孔加入 500 μL 体积分数0.1%Triton X-100，4 ℃过夜。细胞完全裂解后取细胞裂解液转移至96孔板，每组5个复孔，按碱性磷酸酶（alkaline phosphatase， ALP）试剂盒说明操作，酶标仪测定520 nm处各孔的吸光度值。

    译

    1.2.6　成骨相关基因表达检测

    各组细胞分别诱导0、7、14 d后，用TRIzol法提取细胞中RNA，艾本德核酸蛋白测定仪上测定吸光度值，确定RNA纯度，RNA电泳测定RNA完整性后反转录成cDNA，RT-PCR检测相关基因表达量。设置内参基因GAPDH-141bp，实时荧光定量PCR检测各组细胞在不同时间Runt相关转录因子2（runt-related transcription factor 2， RunX2）、骨形态发生蛋白 2 （bone morphogenetic protein 2 ， BMP-2） 、成骨细胞 （Osterix）的基因表达。引物序列见表2。

    译

    表2  引物序列
    Table 2  Primer sequences of qRT-PCR
    GeneSequences（5’→3’）
    GAPDH F： GGCCTCCAAGGAGTAAGAAA
    R： GCCCCTCCTGTTATTATGG
    RUNX2 F1：TGCCCAGTGAGTAACAGAAAGAC
    R1： CTCCTCCCTTCTCAACCTCTAA
    Osterix F1： CCCAACTGTCAGGAGCTAGA
    R1： CAGAGCGAGTGAACCTCTTG
    BMP2 F1： AGTCAGTGGGAGAGCTTCGA
    R1： CTTGGAGACACCTGGGTTCT
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    1.2.7　抑菌检测

    将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、血链球菌接种于肉汤琼脂基斜面，37 ℃培养增殖，稀释成细菌悬液（1×105~1×108） CFU/mL备用。取0、6、12、18、24 μmol/L 黄芩素浸泡滤纸，烘干后放置于涂布实验菌液的琼脂平板上，每组浓度重复测试3次，（35～37） ℃孵育（18～24） h后除测量抑菌圈直径。

    译

    1.3　统计学分析

    采用SPSS23.0进行统计分析，所有数据以例数（n）以及均值±标准差（x¯±s） 表示，验证各组数据符合正态分布且方差齐，进行单因素方差分析（ANOVA）分析组间差异，LSD法进行组间两两比较差异分析，P＜0.05 认为差异有统计学意义。

    译

    2 结 果

    2.1　黄芩素对MC3T3-E1细胞活性及增殖的影响

    CCK-8法比较不同浓度黄芩素对MT3TE-E1细胞增殖的影响，对比各组吸光度值（表3），绘制各组细胞增殖曲线（图1），进行细胞毒性评价（表4）。结果显示与对照组相比，第1、3、7天吸光度值均低于对照组，且浓度越高吸光度值越低。随作用时间增加，各组吸光度值（OD）与细胞增殖率皆有提升。细胞毒性评价显示第1天各浓度黄芩素对细胞增殖无明显影响，第3天时，各浓度的黄芩素组细胞增殖率（%）降至50%～60%之间，第7天各浓度的黄芩素组细胞增殖率（%）均表现再次上升，其中 6、12、18 μmol/L黄芩素组的细胞增殖率（%）都能维持在70%以上，细胞毒性分级也保持在1~2级之间，具有较好的安全性。

    译

    表3  不同浓度黄芩素对MC3T3-E1细胞增殖的影响
    Table 3  Effects of different concentrations of baicalein on the proliferation of MC3T3-E1 cells ( ［（x¯±s，n=5）］ )
    Group1 d3 d7 d
    Control 0.720 2±0.011 8 2.375 4±0.014 0 2.984 8±0.022 8
    6 μmol/L 0.649 2±0.006 1∗ 1.397 0±0.044 0∗ 2.320 6±0.037 8∗
    12 μmol/L 0.624 0±0.014 2∗ 1.273 8±0.020 0∗ 2.097 2±0.048 3∗
    18 μmol/L 0.642 8±0.004 3∗ 1.258 8±0.033 4∗ 2.141 4±0.006 2∗
    24 μmol/L 0.619 6±0.008 6∗ 1.191 6±0.046 6∗ 1.755 4±0.060 8∗

    ∗： P<0.05， compare with the control group（all P<0.001）. By analysis of variance， there were statistically significant difference between the five groups （day 1： F=88.90， P<0.000 1； day 3： F=1 691.03， P<0.000 1； day 7： F=779.00， P<0.000 1）.

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    fig

    图1  不同浓度黄芩素对MC3T3-E1 细胞增殖的影响

    Fig. 1  Effects of different concentrations of baicalein on the proliferation of MC3T3-E1 cells

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    表4  不同浓度黄芩素对 MC3T3-E1 细胞的 RGR和细胞毒性分级
    Table 4  RGR and cytotoxicity of different concentrations of baicalein on MC3T3-E1 cells
    Group1 d3 d7 d
    RGR/%CytotoxicityRGR/%CytotoxicityRGR/%Cytotoxicity
    0 μmol/L 100 1 100 1 100 1
    6 μmol/L 90.14 1 59.70 2 77.75 1
    12 μmol/L 86.60 1 53.62 2 70.26 2
    18 μmol/L 89.30 1 53 2 71.85 2
    24 μmol/L 86.03 1 50.16 2 58.81 2
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    2.2　黄芩素对MC3T3-E1细胞成骨分化的影响

    在不同浓度黄芩素下，成骨诱导黄芩素0、7、14 d，评价MC3T3-E1细胞早期成骨分化。结果表明，7、14 d时，黄芩素组的吸光度值均相较对照组显著增高，且呈剂量依赖性（表5），18 μmol/L黄芩素组的吸光度值显著提高，提高程度可达对照组的2.07倍，提示此组表现出良好的成骨活性。

    译

    表5  成骨诱导后ALP相对定量分析
    Table5  Relative quantitative analysis of ALP after osteogenesis induction ( ［（x¯±s），n=5］ )
    Group0 d7 d14 d
    0 μmol/L 0.019 6±0.010 4 0.048 3±0.002 9 0.094 0±0.020 6
    6 mol/L 0.023 4±0.012 5 0.070 0±0.007 3∗ 0.120 9±0.016 7∗
    12 mol/L 0.024 8±0.017 2 0.080 0±0.014 0∗ 0.146 6±0.006 1∗
    18 mol/L 0.028 0±0.021 2 0.100 0±0.008 7∗ 0.170 0±0.009 4∗

    ∗： P<0.05， compare with the control group （except for the 6 μmol/L group on day 7 P=0.002， and the 6 μmol/L group on day 14 P=0.009， all the other groups were P<0.001 compared with the control group）. By analysis of variance，there were statistically significant difference between the four groups in day seven and day fourtine （day 0： F=0.246， P=0.863； day 7： F=28.93， P<0.000 1； day 14： F=26.32， P<0.000 1）.

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    2.3　黄芩素对MC3T3-E1成骨相关基因表达的影响

    结果可见对照组与各黄芩素组均下调Runx2基因表达水平，且呈浓度依赖性，下调水平与实验时间和实验浓度呈负相关。第14天时，18 μmol/L黄芩素组Runx2基因表达水平较第0天下调将近50 %（图2）。6、12、18 μmol /L的黄芩素可相对对照组上调BMP2基因与Osterix基因的表达水平，呈浓度依赖性（图3，4）。第14天时，对照组与黄芩素组的BMP2表达水平大幅上调，以6 μmol/L黄芩素组上调最显著，其次为12 μmol/L黄芩素组。18 μmol/L黄芩素组的BMP2表达水平略低于对照组。实验周期中12 μmol/L和18 μmol/L黄芩素组的Osterix基因表达水平呈先上调后抑制再上调的规律。第14天时，以12 μmol/L和18 μmol/L黄芩素组上调Osterix基因表达水平最为显著，其上调水平分别是对照组的2.43倍和2.64倍。

    译

    fig

    图2  Runx2 mRNA 在 MC3T3-E1 成骨细胞中的表达情况

    Fig. 2  The expression of Runx2 mRNA in MC3T3-E1 osteoblasts

    ∗: P<0.05，compare with the control group (except for the 6μmol/L group on day 0 P=0.002, all the other groups were P<0.001 compared with the control group). By analysis of variance,there were statistically significant difference between the four groups in these three time (day 0: F=42.78, P<0.000 1; day7: F=74.122, P<0.000 1; day14: F=53.82, P<0.001).

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    fig

    图3  BMP2 mRNA 在 MC3T3-E1 成骨细胞中的表达情况

    Fig. 3  The expression of BMP2 mRNA in MC3T3-E1 osteoblasts

    ∗: P<0.05,compare with the control group (in day 0, 6 μmol/L P=0.026; 12 μmol/L P=0.001; 18 μmol/L P<0.001; in day 7, 6 μmol/L P=0.002. In day 14, 6 μmol/L and 12 μmol/L P<0.001; 18 μmol/L P=0.001). By analysis of variance,there were statistically significant difference between the four groups in day0 and day 14 (day 0: F=1 150.69, P<0.000 1; day 7: F=11.10, P=0.05; day14: F=650.90, P<0.001).

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    fig

    图4  Osterix mRNA 在 MC3T3-E1 成骨细胞中的表达情况

    Fig. 4  The expression of Osterix mRNA in MC3T3-E1 osteoblasts

    ∗: P<0.05, compare with the control group (in day 0, 18 μmol/L P=0.05; in day 7, 12 μmol/L and 18 μmol/L P<0.001; in day 14, 6 μmol/L P=0.009, 12 μmol/L P=0.013, 18 μmol/L P<0.001). By analysis of variance, there were statistically significant difference between the four groups in these three time (day 0: F=7.361, P=0.014; day 7: F=17.12, P=0.012; day 14: F=14.277, P=0.002).

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    2.4　大肠杆菌、金黄葡萄球菌、血链球菌抑菌检测

    K-B 纸片法将0、6、12、18、24 μmol/L 黄芩素作用大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、血链球菌 24 h后观察发现，金黄色葡萄球菌和血链球菌在 12 μmol/L黄芩素组开始出现抑菌圈并表现出抑菌效能，抑菌圈的大小和黄芩素浓度呈正相关（表6~8；图5~7），金黄色葡萄球菌在24 μmol/L 黄芩素组表现出的抑菌圈直径与敏感程度大于血链球菌，提示相同浓度黄芩素对金黄色葡萄球菌抑菌效能优于血链球菌。本次黄芩素所选取的实验浓度在大肠杆菌上并没有表现出抑菌圈，可能是实验浓度未达到大肠杆菌的抑菌浓度。

    译

    表6  黄芩素作用下大肠杆菌的体外抑菌圈直径
    Table 6  In vitro bacteriostatic circle diameter of Escherichia Coli under the action of baicalein
    GroupBacteriostatic circle diameter/mmAverage bacteriostatic circle diameter/mmSensitivity
    123
    0 μmol/L 7 8 7.5 7.5 -
    6 μmol/L 8 7.5 7 7.5 -
    12 μmol/L 7.5 7 7 7.17 -
    18 μmol/L 7 7 7 7 -
    24 μmol/L 6 8.5 7 7.17 -

    “-”insensitive； “+”hyposensitivity； “++”mesosensitivity； “+++”hypersensitivity.

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    表7  黄芩素作用下血链球菌的体外抑菌圈直径
    Table 7  In vitro bacteriostatic circle diameter of Streptococcus Sanguis under the action of baicalein
    GroupBacteriostatic circle diameter/mmAverage bacteriostatic circle diameter/mmSensitivity
    123
    0 μmol/L 7 6.5 7.5 7 -
    6 μmol/L 9.5 7 7.5 8 +
    12 μmol/L 15 11 10 12 +
    18 μmol/L 16.5 17 15.5 16.33 ++
    24 μmol/L 21.5 15.5 18 18.33 ++

    “-”insensitive； “+”hyposensitivity； “++”mesosensitivity； “+++”hypersensitivity.

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    表8  黄芩素作用下金黄色葡萄球菌的体外抑菌圈直径
    Table 8  Diameter of bacteriostatic circle of Staphylococcus Aureus in vitro under the action of baicalein
    GroupBacteriostatic circle diameter/mmAverage bacteriostatic circle diameter/mmSensitivity
    123
    0 μmol/L 9 6.5 8 7.83 -
    6 μmol/L 9 8 11.5 9.5 +
    12 μmol/L 14 14 13.5 13.83 +
    18 μmol/L 14.5 15.5 15.5 15.17 ++
    24 μmol/L 20 22 22.5 21.5 +++

    “-”insensitive； “+”hyposensitivity； “++”mesosensitivity； “+++”hypersensitivity.

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    fig

    图5  黄芩素作用下大肠杆菌的体外抑菌圈直径

    Fig.5  In vitro bacteriostatic circle diameter of Escherichia Coli under the action of baicalein

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    图6  黄芩素作用下血链球菌的体外抑菌圈直径

    Fig. 6  In vitro bacteriostatic circle diameter of Streptococcus Sanguis under the action of baicalein

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    图7  黄芩素作用下金黄色葡萄球菌的体外抑菌圈直径

    Fig. 7  Diameter of bacteriostatic circle of Staphylococcus Aureus in vitro under the action of baicalein

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    3 讨 论

    牙周炎、种植体周围炎等疾病都与牙槽骨长期处于慢性炎症状态，导致牙槽骨内骨重建平衡失调相关。黄芩素提取于黄芩类植物根部，已在中医学领域广泛应用多年。前期研究中已有多名学者证实黄芩素可减轻大鼠实验性牙周炎的炎症，降低牙槽骨的吸收以及牙龈纤维的破坏，也有研究证实在临床进行根面平整术时联用黄芩素营养剂，术后患者患处炎症消退情况、探诊出血情况、牙槽骨恢复情况均优于单纯进行根面平整治疗患者，提示黄芩素在临床治疗牙周支持组织疾病时在菌斑炎症的控制、牙槽骨再生治疗方面的优势，在口腔各类炎症性疾病与骨组织工程均有较好的研究前景［

    5，10-11］。以往有研究表明，黄芩素对多种肿瘤细胞有细胞毒性作用。例如Cheng等［12］发现，黄芩素可激活芳香烃受体（aryl hydrocarbon receptor， AhR ）并促进周期蛋白D1降解，使人口腔鳞状癌细胞HSC-3内磷酸化视网膜母细胞瘤蛋白（phosphorylated retinoblastoma， pRb）水平降低，从而使细胞周期阻滞于G1期，抑制细胞的增殖。在人早幼粒白血病HL-60细胞与口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）细胞中，黄芩素被报道可通过ROS介导的线粒体功能障碍诱导细胞凋亡［13-14］。但也有实验表示，虽然黄芩素在一定浓度以上可使原代人牙龈上皮细胞增殖活性显著降低，但如果降低其使用浓度（10~100 μmol/L）则可具有合格的生物安全性。根据本实验预实验结果可见，50 μmol/L黄芩素培养MC3T3-E1细胞14 d后抑制率达到90%，与以往实验得出的黄芩素有细胞毒性与抑制细胞增殖的结论相符。故根据预实验所得出的半数抑制浓度（IC50）为基础，按100%、75%、50%、25%的比例作梯度细化为本实验的药物浓度。在本研究中，CCK-8结果表明，虽然第3天各浓度黄芩素组细胞增殖率均较对照组下降，但第7天时，6 μmol/L、12 μmol/L、18 μmol/L黄芩素组的细胞增殖率都能维持在70%以上，细胞毒性分级也保持在1~2级之间，提示适宜浓度的黄芩素可轻微抑制MC3T3-E1细胞早期增殖活动，但不会影响其继续增殖。
    译

    为研究黄芩素对MC3T3-E1成骨分化的影响，我们检验了不同浓度黄芩素培养下ALP的蛋白量。ALP可增加无机磷酸盐的沉积率，促进矿化，并降低细胞外焦磷酸盐浓度，从而促进细胞的成熟与钙化，是最广泛认可的早期成骨活性标志物［

    15］。结果表明，在各个时间点，黄芩素组的ALP含量均高于对照组，且呈剂量依赖性，18 μmol/L组的提高程度可达对照组的2.07倍，这表明此浓度的黄芩素可有效提高MC3T3-E1细胞的ALP活性，从而促进该细胞的成骨分化与成熟。
    译

    成骨的过程还需各种因子参与，其中，BMP2具有诱导未分化间充质干细胞向成软骨细胞和成骨细胞定向分化与增殖能力，在骨骼发育、最终的骨形成与骨修复都有至关重要的作用［

    16］。Osterix可通过不同基因的调控对成骨细胞的分化，骨细胞的成熟过程进行控制，且在骨微环境的调控也有潜在作用［17］。Runx2可抑制终末肥大软骨细胞的凋亡，诱导其向成骨细胞和成骨细胞祖细胞的转分化，并且可以激活I 型胶原蛋白 α1 （collagen type I alpha 1，COL1A1）、ALP、骨桥蛋白（osteopontin，OPN）等各种成骨基因表达［18-19］。本实验选择了0、1、7、14 d的时间点验证了各浓度黄芩素对MC3T3-E1成骨相关基因表达的影响，以期观察到黄芩素在不同成骨阶段对前成骨细胞分化的影响。在实验中我们观察到6、12、18 μmol /L黄芩素组的Osterix基因表达水平明显上调，其中18 μmol /L在第0天与第14天上调的最为显著，与对照组相比表现出明显的促进作用。这与Osterix基因在成骨分化中的重要性密切相关，因此我们得出结论：黄芩素组能够通过上调Osterix基因的表达来促进MC3T3-E1细胞的骨分化和成熟。我们同时发现，6、12、18 μmol /L的黄芩素均在实验周期的某一时间点显著上调BMP2基因的表达水平，其中18 μmol/L黄芩素在第0天可显著上调BMP2 mRNA的表达。这与前人对小鼠成骨过程中BMP2表达情况的结果一致：BMP2在成骨过程的前期（大约0~7天）的表达水平呈上调趋势，达到峰值后逐渐下调至基础水平。而检验Runx2基因表达水平时则发现对照组与各黄芩素组均下调Runx2基因表达水平，且呈浓度依赖性，这可能是因为Runx2基因在成骨分化中虽然起到促进作用，但其作用是在成骨分化早期，随着成骨细胞的形成和成熟，Runx2基因的表达水平会逐渐下调［20-21］，这与Kim实验证明的在小鼠中过度表达Runx2会导致小鼠骨质疏松，抑制成熟的成骨细胞形成以及成骨细胞转化为骨细胞，最终骨形成和骨质均减少的结论相符［22］。这提示我们可以通过适宜浓度的黄芩素来调节MC3T3-E1的骨分化与骨成熟，但其具体的机制仍有待进一步研究。
    译

    口腔是连接外消化道与呼吸道的重要场所，微生物多样性在全身各系统位居第二，其微生物群落在口腔乃至全身健康都发挥巨大作用［

    23］。口腔常见疾病牙周病、种植体周围炎均始于微生物引起的慢性炎症性反应，逐渐破坏牙体支持组织，引起牙周支持组织丧失与牙槽骨的吸收［24］。其中金黄色葡萄球菌在患有侵袭性牙周炎的非吸烟患者中的流行率可达60.5%，血链球菌可促进牙周炎相关病原体附着，大肠杆菌脂多糖可通过促进TLR4表达与诱导中性粒细胞释放抵抗素，并且从而介导牙周炎与种植体周围炎的发生［25-28］。本实验通过纸片法研究了可有效诱导MC3T3-E1成骨分化浓度的黄芩素对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、血链球菌的抑菌效果，结果显示金黄色葡萄球菌与血链球菌在黄芩素浓度达到12 μmol/L时开始展现抑菌效果，并且随浓度递增；而实验浓度未达到大肠杆菌的有效抑菌浓度。
    译

    本实验将黄芩素的成骨作用与抑制作用结合，期望探索出既能高效抗菌又能促进成骨的适宜剂量。综合考虑不同浓度的黄芩素对成骨以及抑菌方面同时作用的效果，我们认为18 μmol/L的黄芩素可在保证MC3T3-E1细胞正常增殖的同时，有效的促进细胞的成骨分化与抑制口腔常见菌金黄色葡萄球菌、血链球菌的增殖，为黄芩素在牙周炎、种植体周围炎等疾病治疗的应用提供了一定的理论依据。然而本研究还存在一些不足之处。本实验仅进行了体外细胞实验，缺乏在牙周炎、种植体周围炎细胞模型及体内模型实验的进一步验证，我们将在后续的实验中进一步验证。此外，黄芩素对MC3T3-E1产生的分子机制仍需进一步明确。

    译

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